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海斯摩尔互动讲堂
壳聚糖纳米材料在骨组织工程与再生医学中的研究进展
李晓静 王新木 董研 苟中入/文 2014/04/02

骨组织工程与再生医学,是指体外构建人工骨组织或者利用生物装置、植入生物材料来刺激骨原细胞或干细胞分化,维持和促进成骨细胞增殖,以重建缺损的骨组织。骨组织工程与再生医学依赖于多个因素,主要包括细胞、生长因子、生物支架和稳定的机械环境。自体骨和同种异体骨移植可满足以上要求,但两者均存在不足之处:自体骨骨量极为有限,并且增加了手术部位和伤口愈合期并发症;同种异体骨移植可能引发慢性炎症,甚至产生免疫排斥反应。因此,骨移植修复术的不足促进了人工骨修复生物材料的发展。譬如,已对羟基磷灰石(HA)、A-W玻璃陶瓷、壳聚糖、胶原以及复合材料等已在骨损伤修复中的应用开展了广泛研究。
甲壳素,又名甲壳质、几丁质,化学名称为聚N-乙酰葡萄糖胺,主要存在于甲壳类动物虾、蟹、昆虫的外壳及高等植物的细胞壁中,是世界上第二丰富的天然生物聚合物。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的衍生物,又名几丁糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性。大量研究已证实,壳聚糖还具有抗菌、止血、促进伤口愈合、促进骨再生等优良的生物学效应,也可与胶原、HA、二氧化硅等复合制备成为薄膜、海绵、可注射型水凝胶形式,应用于骨组织修复领域。但是,采用常规方法制备的壳聚糖多孔支架的不足之处在于材料的综合力学性能差,对成骨细胞生长刺激效应以及促进成骨细胞分化相关生长因子表达的效应低。为了弥补这些缺陷,纳米材料逐渐应用于骨损伤修复领域。纳米材料指某一维度具有1~100nm尺寸的材料,具有高表面积体积比,在骨损伤修复领域具有广泛的应用前景。基于目前壳聚糖纳米材料在骨损伤修复中的广泛研究及取得的相关成果,下面就壳聚糖以及所涉及的纳米纤维支架、纳米粒子和纳米复合支架材料的制备方法以及在骨组织工程与再生医学领域的研究进行综述。

1  基于壳聚糖的纳米材料的制备方法

1.1  壳聚糖纳米纤维
壳聚糖纳米纤维的制备方法包括静电纺丝法、自组装法和热诱导相分离法等,其中静电纺丝法的应用较多。静电纺丝法的基本原理是:带电的聚合物溶液或熔体在外加高压静电场力作用下形成喷射流,经溶剂蒸发或熔体冷却干燥后形成纳米纤维。影响电纺射流稳定性和纳米纤维形态的因素较多,主要包括聚合物的性质(如溶液浓度、黏度、表面张力、导电性等)、操作参数(如电压、接收距离、溶液推射速度)以及外部环境(如温度、湿度等)。
静电纺丝技术制备的壳聚糖纤维直径通常在数十纳米至数微米之间,无规则沉积后形成无纺布状的纤维膜,其显著特征是纳米纤维支架具有极高的表面积体积比和高的孔隙率,形态类似于天然细胞外基质的纤维结构。但静电纺丝技术制备的膜通常是二维(2D)的纳米纤维膜,其高孔隙率利于蛋白吸收及细胞黏附,但其孔径较小,使得细胞只能在其表面生长而不能伸入其内部。为了得到大孔径的三维(3D)支架,有学者采用NaCl作为致孔剂,使纳米纤维膜的孔径及孔隙率均有所提高,或采用改变接收装置法、超声法与其他支架复合等方法。
自组装方法制备的纳米纤维较细小,直径平均200nm,长度仅为几微米。纳米纤维直径受壳聚糖分子量、壳聚糖浓度、溶液pH和温度等影响。

1.2  壳聚糖纳米粒子
壳聚糖纳米粒子的制备方法有离子交联法、聚电解质复合法、乳化交联法、乳化液滴聚集法、乳化溶剂扩散法、反向微乳法等。离子交联法中最常使用的离子交联剂是三聚磷酸钠(TPP),多用作药物缓释载体的制备,由于其反应条件简单温和,成为目前壳聚糖纳米粒子制备研究中最常使用的方法。在制备体系中,壳聚糖分子量及浓度、壳聚糖/TPP质量比以及溶液的pH值等均会影响纳米粒的粒径及表面电荷。聚电解质复合法的反应原理同离子交联法的反应原理,壳聚糖与大分子聚阴离子(如羧甲基羟乙基纤维素、肝素、胰岛素和DNA等)可聚合为纳米粒子,作为生物大分子的运输载体。乳化交联法、乳化液滴聚集法、乳化溶剂扩散法、反向微乳法等通常在有机溶剂体系中使用,或制备程序繁琐,所以用其制备纳米颗粒作为生物材料受到一定限制。

1.3  壳聚糖纳米复合材料
磷酸钙是一类包括天然骨组织细胞外无机矿物基质主要成分在内的无机化合物,其最稳定的一种形式是HA,骨骼中的无机矿物为碳酸化羟基磷灰石(CHA)。人们已经发现,不少磷酸钙均可作为骨移植材料植入骨缺损区,逐渐被新形成的骨组织所取代,具有良好的骨引导性。碳纳米管(CNTs)是碳的同素异形体,呈圆柱形纳米结构,长度与直径比可达28000000∶1,结构与化学性能稳定,其最显著的特征是具有较高的机械性能。已有研究证明,将纳米羟基磷灰石(nHA)、纳米磷酸钙、CNTs与壳聚糖基质混合后,采用冷冻干燥、原位合成、沉淀法等方法,可制备成多孔的壳聚糖复合纳米材料支架。另外,人们也发现,nHA、CaO—P2O5—SiO2组成的生物活性无机纳米粒子等与壳聚糖基质混合,逐滴加入甘油磷酸酯二钠盐(GP),持续搅拌后可制备成热塑型的可注射型复合凝胶,由于其具有微创可注射特性,因而在骨损伤修复中备受关注。

2  在骨组织工程及再生医学中的研究

2.1  作为骨组织工程生物支架
在骨组织工程与再生医学中,生物支架的性能至关重要。良好的生物相容性、可降解性、高孔隙率、具有一定的机械稳定性和骨引导性等,是骨组织工程中生物支架所应满足的基本要求。壳聚糖生物支架具有极好的生物相容性,在体内可被溶菌酶等降解为无毒的低聚糖,被人体吸收利用;生物支架具有大孔径及高的孔隙率,可引导组织中的细胞在其表面及支架内部黏附生长增殖,并利于血管形成及骨基质矿化物的形成。但其机械强度相对较低,本身不具有骨诱导性,对细胞生物活性较低。随着材料科学和生命科学的发展,发现纳米纤维支架和纳米复合生物支架可以克服这些缺点。
2.1.1  壳聚糖纳米纤维支架
Shin等采用静电纺丝法制备了壳聚糖纳米纤维膜,纤维直径平均200nm,孔径大小平均5μm,孔隙率80%,抗张强度达10MPa,高于目前临床常用的引导骨再生膜Bio-Gide的抗张强度(约2.94MPa)。但也有学者的研究结果显示,壳聚糖纳米纤维膜的机械强度较低,壳聚糖含量为50%的壳聚糖胶原纳米纤维膜抗张强度仅为1.5MPa,且随着壳聚糖含量增加,纤维膜的抗张强度降低。剪切强度测试表明,交联与未交联的壳聚糖纳米纤维膜均低于临床常用的引导骨再生Bio-Mend膜。可见,壳聚糖纳米纤维膜的机械强度还亟待提高。
Datta等在N-亚甲基磷酸壳聚糖(NMPC)纳米纤维膜与NMPC凝胶支架上植入成骨样细胞,第5天时经细胞染色荧光显微镜观察:纳米纤维膜上的细胞呈多角形,铺展于支架表面,而凝胶支架上的细胞呈簇状分布,且纳米纤维膜上的细胞表现出更高的增殖率及功能活性。由于纳米纤维支架可模拟细胞外基质胶原纤维,比表面积较大,利于细胞的伪足在材料表面黏附,可促进细胞进一步在支架表面生长增殖。
Zhao等将聚丙烯碳酸酯/壳聚糖纳米纤维支架(PPC/CSNFs)、聚丙烯碳酸酯支架(PPC)植入到兔股骨髁突直径为6mm、长为10mm的骨缺损处,16周组织学观察到:植入PPC/CSNFs支架组的缺损边界消失,骨缺损区已完全被新生骨组织所取代,且比PPC支架组的新生骨量多,而空白对照组只有少量的再生骨,边界仍清晰可见。由此表明,壳聚糖纳米纤维支架具有高表面体积比,利于组织中细胞的黏附及生长增殖,从而加速了骨再生修复。
2.1.2  壳聚糖纳米复合材料支架
已有研究发现,纳米磷酸钙、nHA或CNTs与壳聚糖基质混合制备的纳米复合支架具有较高的机械性能,且随着纳米材料含量的增加,机械性能提高,而且三者良好的骨引导性利于成骨细胞在支架表面及内部的生长增殖。将成骨样细胞植入到功能性多壁碳纳米管/壳聚糖复合支架上体外培养,发现细胞可以大量黏附、增殖并向成骨细胞分化。将nHA/壳聚糖海绵样三维支架植入到大鼠颅顶骨直径为6.5mm的圆形骨缺损中,组织学观察,在2周时骨缺损区边缘及支架中心有新骨形成,在5周时植入支架的骨缺损区与空白对照相比已有明显的新骨形成。
由CaO—P2O5—SiO2三元氧化物组成的生物活性玻璃无机纳米粒子及二氧化硅和氧化锆纳米粒子均可与壳聚糖基质混合制备成纳米复合凝胶或支架,复合材料在浸入与人体血浆离子浓度相似的模拟体液中14天后,扫描电镜观察到复合支架表面或孔内均有致密的磷灰石晶体形成。这说明,复合支架表面纳米粒子及降解时游离出的无机纳米粒子可促进骨样矿物盐在支架表面沉积。

2.2  作为生长因子的缓释载体
生长因子是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合,调控细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。骨诱导性生长因子包括骨形态形成蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、血小板源性生长因子等,可在骨修复过程中促进成骨细胞增殖,抑制破骨细胞生长,从而诱导骨形成。壳聚糖纳米粒子可作为骨诱导性生长因子的释放载体,当植入骨缺损区后,释放的生长因子高效调控成骨细胞的生长增殖,进而提高骨再生效率。
有学者采用离子交联法制备了包载BMP-2的壳聚糖微球,平均直径230nm,微球分散性好。用壳聚糖微球浸提液来培养小鼠成纤维细胞,细胞生物相容性较好,无细胞毒性。壳聚糖微球对BMP-2的包载率可达85%,体外研究释放缓慢,释放时间可持续30天。Hou制备的壳聚糖微球表面呈多孔结构,经吸附rhBMP-2后复合到胶原海绵支架上,在兔桡骨15mm节段性骨缺损处植入复合支架,12周后组织学观察发现,吸附rhBMP-2的壳聚糖微粒复合支架组比rhBMP-2/胶原支架组有明显的骨再生,说明壳聚糖微球是rhBMP-2的有效载体,可保持其生物活性。
VEGF可促进血管的再生,利于骨损伤修复中血管网络的建立。有学者将壳聚糖、硫酸葡聚糖和VEGF共混制备的包载VEGF的纳米粒子和游离VEGF分别植入到聚丙交酯—乙交酯(PLGA)支架中,将两种形式的支架植入鼠腹膜脂肪层,2周后采用免疫染色检测内皮细胞数量,采用自体荧光检测红细胞数量,结果显示包载VEGF纳米粒子组内皮细胞和红细胞数量比游离VEGF复合支架组要显著增多,血管再生明显,表明壳聚糖纳米粒子可作为VEGF的有效载体,在骨损伤修复中发挥其促进血管再生的作用。

2.3  作为外源基因的递送载体
壳聚糖带正电荷氨基可以和带负电荷DNA分子通过聚电解质复合法制备成纳米粒子,作为外源基因的递送载体,通过转染到体内细胞经基因表达而发挥其生物性能,是骨再生医学基因治疗中的有效载体。Nie制备了包载BMP-2质粒DNA的壳聚糖纳米粒子复合PLGA/HA支架,研究者将复合支架植入到鼠胫骨的骨缺损处,相比对照组表现出更高且持久的骨愈合能力。实验表明,壳聚糖纳米粒子作为DNA的有效缓释载体,可维持其转染活性,并发挥其有效的生物学活性。壳聚糖纳米粒子对转化生长因子β1质粒(pTGF-β1)包载率可达(87.5±2.3)%,体外释放实验结果显示,初期时释放较快,之后释放缓慢,并随着时间延长释放率逐渐增加,在90天时释放40%左右。壳聚糖/pTGF-β1纳米粒与裸pTGF-β1体外转染软骨细胞,在48h后流式细胞仪检测,两组的转染率分别为(7.18±1.52)%和(0.97±40.70)%,有显著差异。可见,壳聚糖纳米粒可充分包载pTGF-β1,具有良好的缓释性能,且能成功转染体外细胞。
有研究发现,壳聚糖虽能包载DNA和RNA,并能避免核酸被核酸酶降解,但其水溶性小、转染效率较低。将壳聚糖化学改性,在烷基化壳聚糖和巯基壳聚糖包载DNA和RNA后,其转染效率可有所提高。Yu等制备了BMP-4和VEGF121基因的重组质粒,经巯基烷机化壳聚糖和重组质粒聚电解质反应制备了纳米粒子,复合明胶海绵后植入到兔桡骨长度15mm的骨缺损处,结果显示实验组比明胶海绵组骨再生速度快且新生骨量较多。究其原因,可能是改性的壳聚糖纳米粒子增强了与细胞的黏附率、渗透率,使得基因转染率提高。
此外,壳聚糖/聚丙烯酸纳米纤维也可作为质粒DNA的有效载体,已证实可成功转染人类真皮成纤维细胞。

3  问题及展望

通过回顾3种基于壳聚糖的纳米材料在骨损伤修复与再生医学中的研究,发现壳聚糖纳米复合材料可提高壳聚糖支架的机械强度及对成骨细胞的生物活性;壳聚糖纳米纤维支架在结构、形态上与天然胶原纤维相似,类似于天然骨细胞外基质,其纳米级尺寸、高孔隙率、高表面体积比有利于成骨细胞黏附增殖及功能分化,同时也可作为生物活性因子的递送载体;壳聚糖纳米粒子是生物活性因子、外源基因等的有效载体,通过包载具有诱导成骨性的生长因子及外源基因,可提高骨再生能力。
然而,目前主要是对基于壳聚糖的纳米材料的体外及动物体内的研究,但有些问题尚需进一步研究,如其纳米材料的体内降解时间是否能满足骨再生的需求,壳聚糖纳米纤维三维支架的制备和其机械性能的提高,壳聚糖纳米粒子对生物因子、基因的包载率、转染率的提高,以及壳聚糖纳米材料促进前成骨细胞或成骨细胞增殖及分化中的细胞信号转导通路等。同时,制备壳聚糖纳米材料支架也是未来研究方向之一,这种支架既具有高的机械性能,结构、形态类似天然骨细胞外基质,又可作为生物活性因子和外源基因的缓释载体。
另外,作为天然生物材料,壳聚糖主要从甲壳类动物虾、蟹、昆虫的外壳中通过碱处理或酶解脱乙酰化所得,其脱乙酰度(30%~95%)及分子量(30~1000kDa)因原材料来源、制备方法及制备条件的不同而变化。目前,研究对壳聚糖物理性能的要求仅限于壳聚糖的脱乙酰度及分子量,而对壳聚糖提取的纯度、杂蛋白的种类和含量以及安全性标准的研究尚比较缺乏。而且,酸碱化学处理提取壳聚糖的方法对环境会造成一定的影响,其制取方法还需进一步改善。
总之,壳聚糖纳米材料支架和作为缓释载体的壳聚糖纳米粒子在骨组织工程与再生医学的研究中具有广阔的空间,且有望在骨缺损修复再生中得以临床应用。
(转载《中国生物医学工程学报》)

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